高速離心機分離血清脂蛋白的原理與步驟

用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份（HDL，VHDL）比較成功，而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。
　　
　　血清脂蛋白是由血液中脂質與某些特異的蛋白質組成的一類不均一的復合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同，其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶即：乳密顆粒，極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。
　　
　　一．梯度材料：血清脂蛋白密度較低，常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的緩沖劑為ED。
　　
　　二．預分離：
　　
　　1.血細胞與血清分離：
　　
　　離心參數(shù)：全血，角轉頭，3，000rpm×20min
　　
　　結果：沉淀為血細胞，上部為血清。
　　
　　2.乳糜粒分離：禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少，已進食者因其血漿含乳糜粒高，應先離心去除乳糜粒。
　　
　　離心參數(shù)：4×10（g×min）,10°C.各種轉頭轉速均可。
　　
　　梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0。5MnaCl 0.3MEDTA,ph7.4
　　
　　結果：乳糜粒上浮，吸出。
　　
　　3.血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質。
　　
　　離心參數(shù)：（2。5-3）×10（g×hr）,各種轉頭均可。如角轉頭70，000rpm×6hrs,10°C
　　
　　配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
　　
　　結果：管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
　　
　　三．方法：
　　
　　1．順序浮選法：
　　
　　a）超速法：zui早使用的方法，4000rpm×24hrs×3次，10°CNaCl NaBr梯度按1。006，1。063，1。21順序浮選，每次在管上部取出不同密度之
　　
　　脂蛋白。操作簡單，分辨率高，得率高，費時，成本高。
　　
　　b）超高速法：100，000rpm×2.5hrs×2次，10°C,100，000rpm×4hrs×1次，NaCl KBr EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL，LDL，HDL
　　
　　2．單次離心法：
　　
　　a）單次水平分離
　　
　　用zui高轉速為25，000~28，000rpm,6×40ml甩平轉頭以1.006g/mlNaCl液及1。35g/ml（NaCl KBr EDTA）液配置成從1。006至1。21的8層不
　　
　　連續(xù)階梯度，zui下部用血清與KBr配成1。25g/ml樣品液，25，000rpm×4hrs,4oC一次得到VLDL，LDL，HDL不同層區(qū)帶。
　　
　　用zui高轉速為40，000rpm，6×13ml甩平轉頭，40，000rpm×24hrs，20°C，不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細長管，分層清晰，回收率
　　
　　高，離心時間長
　　
　　b）單次垂直管分離：
　　
　　NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml，轉速從50，000rpm~80，000rpm，離心（0。5-3）hrs,下層用KBr或（NaBr）將血清調至1
　　
　　。3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液，10°C-20°C，增加，減速一次分出。NaCl/Sucrose不連續(xù)梯度下層為48%W/WSucrose,中層血清在4MnaCl
　　
　　中，上層為0。67MNaCl 0.05%EDTA,離心參數(shù)同上，時間較長。
　　
　　c）區(qū)帶轉頭大容量分離：
　　
　　離心參數(shù)：區(qū)帶轉頭，zui高轉速30，000~48，000rpm,容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載，分離轉速：大轉頭
　　
　　（25,000-28,000rpm）×24hrs，小轉頭（30,000-38,000rpm）×1hrs，10°C-20°C
　　
　　梯度液：NaCl NaBr或KBr EDTA不連續(xù)或線性梯度，樣品在zui大密度層，近轉頭核心處用純水做隔離層，分離室zui外部用高密度NaCl/KBr或
　　
　　NaCl/NaBr作緩沖層。
　　
　　收集：泵出后依此經(jīng)帶流動地的紫外檢測儀檢測，自動部分收集器收集。
 

                                                   文章來源：北京綠野創(chuàng)能機電設備有限公司